ANTI-INFLAMATORY STUDY OF A SELECTED FORMULA Part-2

Bahan kimia

Sodium diklofenak {monosodium 2-[(2,6-dichlorophenyl)amino]benzene acetate} (CAS 15307-79-6) disuply oleh Roig Farma. (Barcelona, Spanyol). Isopropylamine, d-limonen, lauric acid, oleic acid, dan carragenan diperoleh dari Aldrich (Alcobendas, Spanyol). Polyglyceryl oleate (Plurol oleique^®), isostearyl isostearate, saturated polyglycolyzed glyceride (Labrasol^®) dan diethylene glycol monoethyl ether (Trancutol^®) disediakan oleh Gattefosse (Saint-Priest, Perancis). Methanol, acetonitril, disodium phosphate, moopotasium phosphate, sodium chloride, ammonia 30% dan asam asetat glacial, semuanya memiliki grade HPLC, didapat dari Merck (Darmstadt, Jerman).

2.2. Membrane permeasi

Kulit manusia diperoleh dari operasi plastic (Hospitaal de Barclona, SCIAS, Barcelona, Spanyol) digunakan sebagai membrane permeasi. Kulit tersebut diperoleh dari kulit wanita sehat berusia 40 tahun. Setelah didinginkan sampai -20°C, kulit tersebut dipotong dengan dermatome (Model GA 630, Aesculap, Tuttlingen, Jerman) menjadi bagian-bagain yang memiliki ketebalan 400 µm, dari stratum corneum (OECD, 2000).

Subyek telah mengisi informed consent berkenaan penggunaan kulit tersebut untuk tujuan penelitian. Protokol eksperimen telah disetujui oleh Bioethics Committee of Hospital de Barcelona, SCIAS (Spanyol).

2.3. Hewan

Tikus Sprague-Dewley betina (150 – 200 g) dan kelinci jantan (1,9 – 2 kg) diperoleh dari Harlam Iberica (Sant Feliu de Codines, Barcelona, Spanyol).

Institusi komisi etik hewan (Institutional Animal Ethics Committee) universitas Barcelona menyetujui semua prosedur experiment in vivo yang dilakukan.

2.4. Formulasi

Tiga jenis system pelarut (M4, M5 dan M6) dan mikroemulsi (M3) disiapkan untuk penggunaan topical. Semuanya mengandung 1% (w/w) sodium dikkofeak dan dikarakterisasi dengan hamburan cahaya (light scattering) di Departement of Tensioactive Technology di  Center for Researce and Development, CSIC (Barcelona, Spanyol). Formulasi dipreparasi untuk skala laboratorium dan pada suhu kamar dengan melarutkan sodium diklofenak dalam campuran transcutol/air, dan kemudian menambahkan dan mengaduk bahan yang lainnya. Campuran akhir disonikasi selama 3 menit.

Sebagai tambahan, 1% (w/w) sodium diklofenak dalam sediaan komersial dan larutan 1% (w/w) sodium diklofenak dalam transcutol/buffer (19:80) diuji sebagai ormula standar.  

Konsentrasi obat yang tetap yang digunakan pada masig-masing formula, digunakan untuk membandingkan efek pembawa pada absorbsi perkutan dari sodium diklofenak, dan karena formula digunakan secara klinis pada kulit dengan dosis terbatas. Komposisi masing-masing formula dapat dilihat dari Tabel 1.

Ukuran partikel fase terdispers (dalam nm) dari tiap-tiap formulasi ditentukan dengan hamburan cahaya dinamis (dynamic light scattering) (Photon correlation spectrometer Malvern 4700, Malvern Instruments, Malvern, UK) adalah 37.40±0.62 untuk M3, 3.30±0.28 untuk M4 dan 11.63±0.21 untuk M5. Sedangkan M6 tidak dapat ditentukan ukuran partikelnya karena berada di bawah tingkat sensitivitas dari teknikyang digunakan.

2.5. Prosedur Analisis

Kandungan sodium diklofenak pada masing-masing sample dianalisis dengan HPLC (HPLC system 400, Kontron Instruments, Switzerland). Kromatograf dilengkapi dengan dua pompa (model 420), variable detector UV diatur pada 258 nm, 460 auto-sampler, dan 450 data-system. Analisis dilakukan pada suhu kamar dengan kolom C₁₈ Nova pack (diameter partikel 4 µm, 8 x 10 mm) (Waters, Milfford, MA, USA). Fase gerak, mengandung methanol – 20 mM ammonium asetat pada pH 7.0 dengan 0.1% isopropyl amine (65:35), yang dipompakan dengan laju 1.5 ml/min. kalibrasi dibuat dengan metode standard external.

Kurva kalibrasi dengan rentang konsentrasi dari 20 – 0.05µg/ml digunakan untuk mengukur kadar sodium diklofenak dari sample dan untuk memvalidasi teknik analisis yang digunakan. Teknik analisis, divalidasi secara intra- dan inter-day (n=6), adalah linier (P>0.05) berdasarkan statistic yang diterapkan, presisi dengan persentase koefisien variasi (CV%) antara 1.90 dan 7.39%, dan akurasi dengan relative error sebesar – 4.7 dan 2.20%.

2.6. Studi permeasi

Studi permeasi dilakukan di gelas amber Franz-type sel difusi (FDC 400, Crown Glass, Somerville, NY, USA) dengan area difusi seluas 1.86 cm² yang dilekatkan dalam automated setup (Microette^®, Hanson Research, NY, USA). Sample kulit disituasikan antara ruang donor dan receptor dari sel, dengan sisi kulit yang kontak dengan reseptor medium. Studi formulasi (1 g) bertempat di kompartemen donor dan selnya ditutup dengan aluminium foil. Ruang receptor diisi dengan 11 ml PBS (phosphate-buffered saline, pH 7.4) dan disimpan pada 32±0.5 °C dengan jaket aliran air (circulating-water jacket). Sebesar 500µl diambil secara otomatis dari kompartemen receptor setelah 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 dan 24 jam dan digantikan dengan PBS dengan volume yang sama pada suhu 32 °C. Kondisi sink dijumpaipada semua kasus. Penentuan parallel keempatnya dilakukan menggunakan kulit dari donor yang sama.

2.7. Penentuan jumlah obat yang tersisa di kulit

Di akhir dari studi permeasi, formulasi yang tersisa pada kulit dieliminasi dan kulit dipindahkan dari Franz cell, dibersihkan dengan kain kasa tipis yang direndam dalam 0.05% larutan sodiumlauril sulfat dan dicuci dalam aquadest. Area permeasi pada kulit diambil dan ditimbang, dan kandungan diklofenaknya diekstraksi dengan methanol. Menghasilkan larutan yang disentrifuse (1500 rpm) dan kadar sodium diklofenaknya (dinyatakan dengan µg/g kulit) diukur dengan HPLC.

2.8. Parameter penyebaran pada kulit

Data eksperiment diproses menurut metode dosis terbatas ( OECD, 2000 ) menggunakan persamaan (1) untuk menyesuaikan permeasi obat versus waktu (Hashida et al., 1988), mengaplikasikan software LAPLACE (Micromath, Salt Lake City, UT, USA) dan menggunakan parameter P₁ dan P₂ menurut Okamoto et al. (1986):

Persaman (1) dimana :

P₁= K.L     (2) dan

P₂= D/L²    (3)

K adalah koefisien partisi fase membrane/ donor, L adalah ketebalan membran dan D adalah koefisien distribusi. A, X₀, V₁ dan s secara berturut-turut adalah area membran jumlah obat pada waktu  ke-0 pada kompartemen donor, volume kompartemen donor dan operator Laplace.

Persamaan (1) telah dicoba untuk data eksperimen (permeasi obat vs waktu) dan parameter P₁ dan P₂ telah dihitung. Koefisien permeabilitas diperoleh dari persamaan

K_p= P₁.P₂   (4)

Untuk menentukan flux maksimum menggunakan model dosis terbatas(J_max), dinyatakan sebagai waktu vs permeasi obat (Q):

   = Q . S            (5)

Dimana s adalah operator kompleks dari Laplace dan   transformasi

         ( 6 )

Permeasi obat pada 24 jam telah diukur pada  percobaan sebagai parameter independen dari model.

Menurut Flynn dan Stewart (1988), prediksi maksimal konsentrasi obat yang berpenetrasi ke dalam kulit manusia setelah pemberiaan topikal dapat diprediksi dari

C = J_max . A/Cl_p                                             (7)

Dimana J_max adalah maksimum flux yang ditentukan, a adalah area aplikasi dan Cl_p adalah clearence plasmatik.

2.9. Tes Anti-inflamasi

Tikus betina Sprague-Dewley (6-12 per grup) ditetapkan sebagai grup berat-seimbang (kontrol tanpa perlakuan, M4 dan perlakuan preparasi semisolid). Untuk menginduksi lokal inflamasi, 50 μl dari 1% karagenan (w/v) dalam saline telah diinjeksikan dalam permukaan datar kaki belakang  sebelah kiri tikus pada wktu ke-0, meggunakan jarum no.27 dengan 100 μl Hamilton syringe. Pada percobaan pertama, 30 menit kemudian, 100 μl dari M4 atau preparat semisolid diaplikasikan, tidak oklusif, ke kaki binatang pada grup kedua dan ketiga dioleskan dengan lembut. Pada percobaan kedua 500 μl dari preparat topikal diaplikasikan ke 4x3 cm² area punggung yang telah dicukur dan digosokan secara lembut ke kulit. Punggung telah dicukur sebelumnya dengan electric clippers. Bintang kemudian ditempatkan pada kandang polypropylene dengan kerangka logam berlubang diatas lantai untuk mencegah absorpsi produk yang telah diaplikasikan oleh serbuk gergaji. Binatang dirawat tanpa pemberian makan dan minum selama percobaan. Seluruh percobaan dilakukan antara jam 9 pagi sampai 3 siang.

Peningkatan pada ketebalan tulang telapak kaki diukur dengan Mitutoyo dial thickness no.7301 sebelum waktu ke-0 dan 1, 2, 3, 4 dan 5 jam setelah pemberian karagenan. Prosentase peningkatan volume kaki dari waktu ke-0 dihitung. Waktu dari efek anti-inflamasi ditentukan.

2.10 Perkiraan Iritasi Kulit

Iritasi M4 dan preparat semisolid ditentukan pada kelinci albino jantan(1.9-2 kg) mengikuti petunjuk internasional masa ini (OECD, 1992) berdasarkan metode yang dideskripsikan  Draize et al. (1944). Area punggung yang telah dicukur dengan clippers 24 jam sebelum dimulainya pengujian. Tiga kotak digambarkan pada tiap bagian punggung tiap kelinci, dan tiga  bagian kotak kulit tersebut digores dengan pisau bedah. Kemudian 0,5 ml tiap produk diaplikasikan pada tiap kotak. Tempat tersebut kemudian di bungkus dengan gauze dan polyethylene film (parafilm) dan ditutup dengan plester lengket hypoallergenic. Tiga binatang digunakan tiap produk. Setelah pemaparan selama 24 jam, zat tes telah hilang dan kulit yang tidak terlindungi dibuat penilaian untuk pembentukan edema (tingkatan 0-4), dan erythema (tingkatan 0-4). Penilaian diulangi 72 jam kemudian. Penunjuk iritasi utama individu ditentukan tiap kelinci oleh penambahan nilai edema dan erythema pada 24 jam dan 72 jam dan membagi hasilnya dengan 4, disarankan oleh ”journal official de la Republique Francaise” pada 24 oktober 1984. nilai rata-rata untuk tiga kelinci dihitung. Menurut perhitungan indeks nilai iritasi, formula diklasifikasikan sebagai ”non-irritant”(<0,5), ”irritant”(2-5), ”highly irritant” (5-8).

2.11. Statistik

Nilai rata-rata perbandingan antara area kromatografi dan konsentrasi yang diharapkan (AUC/C) dibandingkan oleh ANOVA untuk tes liniearitas metode analisis (P≤0,05). Logaritmik parameter permeasi dibandingkan menggunakan pengujian statistik parametrik (ANOVA tes), mengikuti tes perbandingan perkalian Scheffe’s (P≤0,05). Data inflamasi dianalisis menggunakan ANOVA dari model linier berisi formulasi dan waktu sebagai penyebab variasi.